[헬스코리아뉴스 / 이슬기] 다양한 크리스퍼 유전자 편집기의 표적 특이성을 초민감도로 검측할 수 있는 기술을 국내 연구진이 개발했다. 향후 특정 변이 유전자로 인해 발생하는 희귀성 난치 질환 및 유전 질환 치료제 개발에 큰 기여를 할 것으로 기대된다.
한국생명공학연구원(원장 김장성, 이하 생명연) 국가영장류센터 이승환 박사팀, 미래형동물자원센터 김선욱 박사팀(교신저자: 이승환/김선욱 박사, 제1저자: 강승훈 석사과정 학생)과 한양대학교 의과대학 허준호 박사팀(교신저자: 허준호 교수)이 공동으로 수행한 연구다.
유전자 가위로도 불리는 크리스퍼(CRISPR) 시스템은 박테리아, 고세균에서 발견되는 면역체계의 일종으로, 표적 DNA에 결합하여 이중 나선 절단을 유도한다고 알려져 있다. 이 시스템은 생명체 유전체 교정에 보편적으로 사용되고 있다.
그런데 CRISPR 유전자 가위들은 목표 유전자외 비표적 유전자를 의도치 않게 절단하는 문제로 인해, 유전자 치료제로서 인체 적용 시 보완해야할 점으로 비표적 절단 이슈가 지적되고 있다.
이러한 비표적 절단 여부를 검증하기 위해서 다양한 CRISPR 유전자 가위들에 대해 오작동 여부를 검증하는 시스템이 구축되었지만, 1% 이하의 오작동을 감지하기에 민감도 면에서 보완된 시스템이 필요했다.
연구팀은 CRISPR 유전자 가위에 대하여 오작동 여부 검출을 고민감도로 측정하기 위해 표적 DNA를 증폭시켜 차세대 염기서열 분석을 통해 오작동 여부를 확인하는 방법을 구축했다.
연구팀은 실험을 통해 CRISPR 유전자 가위에 의해 생긴 1% 이하의 오작동 표적 DNA들이 증폭 시스템에 의하여 신뢰할 만한 수준에서 정확하게 검측될 수 있음을 확인했다.
연구책임자인 이승환 박사는 “동 연구성과는 미세하게 존재하는 유전자 가위의 오작동 여부를 표적 DNA를 증폭시키는 방법에 의해 기존 방법들보다 혁신적으로 증가된 민감도 수준에서 검측할 수 있다는 사실을 밝힌 것”이라며, “개발된 방법은 가이드 RNA를 근간으로 작동하는 다양한 유전자 가위 시스템에 적용될 수 있고, 다양한 유전 질환, 희귀성 난치 질환 등의 유전자 치료제 개발에 있어서 안전성 검증 면에서 큰 기여를 할 것으로 기대된다”고 밝혔다.
이번 연구는 과학기술정보통신부와 한국연구재단이 추진하는 신진연구자지원사업과 국가과학기술연구회가 진행하는 BIG(Big Issue Group) 사업 지원으로 수행되었다. 연구결과는 생물학 분야의 세계적 저널인 Nature communications지(IF 12.121) 온라인 판에 게재되었다.
[용어설명]
1. CRISPR 유전자 가위
◦ 박테리아 및 고세균에서 분리된 바이러스 대응 면역체계중 하나의 시스템. CRISPR-Cas 단백질과 가이드 RNA 복합체로 구성되어 있음. 현재 표적 DNA 내에서 목표 염기서열을 정확히 인식하여 이중 나선 절단을 유도할 수 있는 기능으로 많은 생명체의 염색체상 유전자 조절에 이용되고 있음.
2. 단일 염기 치환 유전자 편집기
◦ 활성을 없앤 CRISPR 유전자 가위 기반으로 염기를 치환할 수 있는 도 메인을 연결하여 목적하는 유전자 내 단일 염기 치환을 유도할 수 있는 DNA 교정 도구.
3. 가이드 RNA(guide RNA)
◦ CRISPR-Cas12a에 해당하여 crRNA 라고도 칭하며, 기본적으로 타겟에 상보적으로 결합하는 protospacer 부분과, 보존된 구조를 이루는 direct repeat 영역으로 나누어짐. Protospacer 부분을 타겟팅하는 유전자마다 상보적으로 결합할 수 있도록 바꾸어주게 되면, CRISPR-Cas12a를 원하는 유전자 염기서열에서 작동시켜 이중 나선 절단을 유도할 수 있다.
4. 유전자 가위 오작동
◦ CRISPR 유전자 가위 작동시, 가이드 RNA에 기반하여 표적 DNA를 인식하는 성질 때문에, 표적 염기서열 이외에 비슷한 염기서열을 가진 비표적 염기서열에 작동하여 생체내 오류를 일으키는 현상.
[연구결과 개요]
□ 연구배경
○ 현재 상용되는 제3세대 표적 특이적 유전자 가위인 크리스퍼(CRISPR) 시스템은 Cas 단백질과 가이드 RNA 기반의 중합체로 작동하여, 제작이 용이하고 저렴하기 때문에 차세대 유전자 치료제로써 널리 각광받고 있음.
* 가이드 RNA : CRISPR-Cas 시스템이 표적 DNA에 바인딩하기 위해서 표적 DNA 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함한 RNA 구조체
○ CRISPR 유전자 가위 시스템은 표적 DNA에 상보적 염기서열을 가진 RNA 핵산 기반의 가이드를 이용하여 표적 DNA 염기서열을 인식하고, 활성화된 도메인을 이용하여 표적 DNA에 이중 나선 절단을 유도함.
○ CRISPR 유전자 가위 및 이를 기반으로 한 유전자 편집기들은 여러 비표적 절단이 많은 성질로 인하여 인체 대상 유전자 치료제로써 적용시 안전성 여부를 정밀하게 검토하는 것이 필요함.
○ 기존 유전자 가위의 오작동 여부를 전장 유전체 수준에서 검사하는 방법들은 낮은 시퀀싱 리드수의 한계로 인하여 정밀도 면에서 보완할 기술이 필요한 실정임.
□ 연구내용
○ 연구팀은 최근 유전체 교정 및 제어에 범용적으로 사용되는 CRISPR 유전자 가위에 대하여 미세하게 발생한 오작동 여부를 초민감도 수준에서 검출하는 시스템을 개발하였다.
○ 이 연구에서 연구팀은 표적 DNA 증폭 시스템을 이용하여 다양한 CRISPR 유전자 가위에 대하여 미세하게 발생한 오작동 흔적을 검출할 수 있었다.
○ 기존 보편적으로 사용되는 CRISPR-Cas9, CRISPR-Cas12a 유전자 가위와 단일 염기 치환 유전자 가위에 대해서 발생하는 미세한 오작동 (1%이하 수준)을 증폭하여 정확하게 검출 해내었다.
○ 즉, 본 연구의 성과는 기존 보편화된 CRISPR 유전자 가위 시스템에 대하여 DNA 증폭을 통해 1% 이하로 발생한 미세한 오작동도 검출할 수 있음을 규명한 것이다. 그 결과 특정 CRISPR 유전자 가위의 오작동 여부 판단의 정확성을 획기적으로 증진 시킬 수 있었고, 유전자 변이에 기인한 다양한 인체 질병에 CRISPR 시스템을 치료제로 적용시 안전성 문제 판단에 중요하게 적용될 수 있다.
□ 연구성과의 의미
▶ 보편화된 CRISPR 유전자 가위 시스템에 대한 초민감도 오작동 측정 기술 개발: 다양한 유전자 변이에 의해서 발생한 질병의 치료제 개발시 정확한 안전성 판단 가능
○ 본 연구의 CRISPR 유전자 가위에 대한 초민감도 오작동 검출 기술 개발은 특정 유전자의 변이에 의해 생긴 다양한 유전 질병에 대하여 안전한 유전자 치료제 개발에 큰 기여를 할 것으로 기대된다. 특히 기존 차세대 염기서열 분석법(NGS) 기반 검측 기술로 발견하지 못한 미세 오작동들에 대해서도 검출 가능하다는 점에서 본 개발은 안전성 면에서 파급효과가 클 것으로 사료된다.
○ 또한, CRISPR 유전자 가위의 정확한 안전성 측정 기술을 기반으로 다른 범용 유전자 가위에도 본 기술의 원리가 적용될 수 있을 것으로 예상된다.
[연구팀 인터뷰]
Q, 이번 성과 뭐가 다른가?
기존에 범용적으로 사용되던 CRISPR 유전자 가위에 대하여 1% 이하의 미세하게 발생한 오작동을 정확하게 검출할 수 있는 방법을 개발 한 것이다.
Q, 어디에 쓸 수 있나?
첫째, 인체 대상 유전자 치료제 개발시 유전자 가위 기술의 안전성 평가 목적으로 사용한다. 의료 산업에 파급효과가 클 것으로 보고 있다.
둘째, 동·식물, 미생물등 다양한 생체내에서 유전자를 안전하게 조절하기 위한 사전 안전성 평가가 가능하다. 바이오 산업에 파급효과가 클 것이다.
Q, 실용화까지 얼마나 걸리겠내?
본 연구결과는 기존 유전자 가위에 대해 오작동 여부를 초민감도로 검출하는 방법을 제시하는 기초연구로서, 다양한 생체 대상 안전한 유전자 가위 적용을 위하여 세포 단계에서 유전자 및 생체 대상 다양화 실험을 거쳐 실용화할 것으로 예상된다.
Q, 실용화를 위한 과제는 무엇이라 생각하나?
현재 개발된 초민감도 유전자 가위 오작동 검출 기법은 표적 유전자 증폭 기술과 차세대 염기서열 분석법을 병행하여 진행한다. 이에 따른 가격과 진행과정 간소화 절차를 거쳐 실용화가 가능하다.
Q, 연구은 어떤 계기로 시작하게 됐나?
현재 범용적으로 사용하는 CRISPR-Cas9, CRISPR-Cas12a, 단일 염기 치환 유전자 가위에 대해서 전장 유전체 수준, 오작동 여부를 측정 하였을 때, 시퀀싱 리드수 부족에 의한 저민감도 이슈가 극복해야할 문제로 남아있는 상황이다. 향후 인체내 치료제로 CRISPR유전자 가위 적용시 가장 중요한 문제는 안전성이라는 점에서 본 연구를 시작하게 됐다.
Q, 연구 과정에 에피소드가 있었나?
본 연구 진행 이전, CRISPR 유전자 가위를 개량하여 표적 특이성을 높이는 과정에서 오작동을 보다 자세히 비교해보는 과정에서 본 연구결과를 얻을 수 있었다. 다양한 프로젝트간에 서로 교차되는 접점을 찾으면 의외로 좋은 결과를 얻을 수 있다는 사실을 깨달았다.
Q, 꼭 이루고 싶은 목표는?
현재 개발된 기술은 CRISPR 시스템의 가이드 염기서열에 의존하여 컴퓨터 예측 기반의 정밀도를 높인 미세 오작동 분석 방법이다. 본 기술과 병합하여 향후 전장 유전체 시스템에서 오작동 검측 민감도를 극대화 시키려는 목표를 가지고 있다.
Q, 신진연구자를 위한 조언 한마디 해달라.
본 연구 과정에서 결과가 생각한 가설대로 진행되는 것이 신기하였고, 다양한 유전자 가위 기술에 적용되는 시스템을 개발하였을 때 값진 희열을 느꼈다. 실험 과정 중 당연히 생기는 난관을 다른 학문과 융합하거나 프로젝트간의 접점을 찾아 생각해보면, 의외로 쉽게 해결할 수 있다. 연구자간의 긴밀한 네트워크를 갖추고 융합하는 학문을 받아들이는 마인드를 가지는 것이 중요하다고 생각한다.
